偶看新闻监控每天都做什么:sitefinding-PCr
来源：百度文库 编辑：偶看新闻 时间：2024/04/28 05:24:33
我的问题已经得到了Tiger老师的详细答复，非常感谢热心的Tiger老师!!
经Tiger老师同意，现将答复的内容贴在下面供大家参考：
问： tail-PCR和sitefinding-PCR那一个更可靠些？还是各有长处？
2 sitefinder的设计中，5‘端到酶切位点的这一段是不是主要是为了让非特异性产物形成loop？那么这一段序列是否可以通用？还是有别的考虑？
3 SFP引物和特异性引物的设计要考虑哪些因素？是否要考虑退火温度的问题？
4 在taq酶的选择上，是否必须是不加A的taq酶？
5 退火温度的设定要考虑哪些因素？
答
1 tail-PCR和sitefinding-PCR都可靠，但是后者操作起来简单的多。
2 酶切位点是为了克隆而设计的，也就是说可以用其他酶切位点，但是现在我发现产物可以直接用来测序。
3 引物最好不要自身形成二级结构，退火温度大于60度就行。
4 可以不用不加A的taq酶，但是我在国内的时候发现一个最佳组合是天为的long taq加TaKaRa的LA buffer I
问：酶切位点前的那一段（就是形成loop的那一段）是否可以通用？如果要自己设计，要考虑谢什么因素？
答：酶切位点前的那一段可以通用，目前已经成功用于细菌，病毒，拟南芥，斑马鱼。
另外说明：
如果你要扩增微生物的未知序列，SiteFinder的3/-端可以不加N，但是得保证SiteFinder，以及与此对应的引物自身不形成二级结构；如果要扩增植物或者动物的未知序列，我已经将SiteFinder 优化，将其换成了
5'-GACACGCTACTCCAACACACCACCTCGCACAGCGTCCTCAA cctgcaggI(TGC)I(ATC)IGCTC-3' (将原来的NNNN换成了I（TGC）I（ATC）I将原来的NotI位点换成了Sse8387 I位点，（TGC）表示该位点是T或G或者C，即简并位点，设计引物时用一个字母代替，可能不同的公司用的字母不完全一致)。使用该序列一般只需要两轮扩增即可得到很好的结果，产物可以直接用原来用来做第三轮扩增的已知序列特异引物测序。
经Tiger老师同意，现将答复的内容贴在下面供大家参考：
问： tail-PCR和sitefinding-PCR那一个更可靠些？还是各有长处？
2 sitefinder的设计中，5‘端到酶切位点的这一段是不是主要是为了让非特异性产物形成loop？那么这一段序列是否可以通用？还是有别的考虑？
3 SFP引物和特异性引物的设计要考虑哪些因素？是否要考虑退火温度的问题？
4 在taq酶的选择上，是否必须是不加A的taq酶？
5 退火温度的设定要考虑哪些因素？
答
1 tail-PCR和sitefinding-PCR都可靠，但是后者操作起来简单的多。
2 酶切位点是为了克隆而设计的，也就是说可以用其他酶切位点，但是现在我发现产物可以直接用来测序。
3 引物最好不要自身形成二级结构，退火温度大于60度就行。
4 可以不用不加A的taq酶，但是我在国内的时候发现一个最佳组合是天为的long taq加TaKaRa的LA buffer I
问：酶切位点前的那一段（就是形成loop的那一段）是否可以通用？如果要自己设计，要考虑谢什么因素？
答：酶切位点前的那一段可以通用，目前已经成功用于细菌，病毒，拟南芥，斑马鱼。
另外说明：
如果你要扩增微生物的未知序列，SiteFinder的3/-端可以不加N，但是得保证SiteFinder，以及与此对应的引物自身不形成二级结构；如果要扩增植物或者动物的未知序列，我已经将SiteFinder 优化，将其换成了
5'-GACACGCTACTCCAACACACCACCTCGCACAGCGTCCTCAA cctgcaggI(TGC)I(ATC)IGCTC-3' (将原来的NNNN换成了I（TGC）I（ATC）I将原来的NotI位点换成了Sse8387 I位点，（TGC）表示该位点是T或G或者C，即简并位点，设计引物时用一个字母代替，可能不同的公司用的字母不完全一致)。使用该序列一般只需要两轮扩增即可得到很好的结果，产物可以直接用原来用来做第三轮扩增的已知序列特异引物测序。