360安全检测怎么关:蛋白质Western-Blot检测操作程序

蛋白质Western-Blot检测操作程序（转）

默认分类 2007-12-25 17:52:51 阅读991 评论0   字号：大中小 订阅

一.所需仪器设备

1.电泳仪

2.垂直电泳槽

3.转移电泳槽:湿转或半干转电泳槽

4.硝酸纤维素膜(NC膜)

5.暗盒

6.5x7cm X胶片

[注：电泳槽、玻璃板、梳子及胶条的清洗：自来水冲洗数次――去离子水冲洗数次2次――37C烤干备用。]

二.所用试剂

[注：配制及稀释试剂均用去离子水，实验器皿自来水清洗完毕再用去离子水冲洗]

1.Lysis buffer：RIPA 三去污剂裂解缓冲液

 50mM Tris.Hcl                                  3.03g

  150mM NaCl  生理盐水                           4.35g

  0.02%NaN3（防腐剂，可以不加）                  0.1g

  0.1%SDS  强阴离子去污剂                        0.5g

  1% NP-40 去污剂                                5ml

  0.5% Sodium deoxycholate 去氧胆酸钠  去污剂    2.5g

配制500ml,10M盐酸调PH8.0, 4度保存。

使用前按1：50加入100mM PMSF(苯甲基磺酰氟，平时放-20度)和protease inhibitor(先溶在2ML水中，分装在小管中，保存在-20度)，配好后马上使用。也可分装成(RIPA300ul+6ul100mM PMSF+6ulprotease inhibitor)(培养细胞及微小组织蛋白提取)若干管，-20度保存；分装成(RIPA1000ul+20ul100mM PMSF+20ulprotease inhibitor)(较大组织蛋白提取)若干管，-20度保存。

[注：也可使用单去污剂裂解缓冲液，将1% NP-40换为1%Triton X-100。去掉0.1%SDS及0.5% Sodium deoxycholate 去氧胆酸钠]

PMSF储存液 100mM(17.4mg/ml)，溶于异丙醇。有效浓度100ug/ml。

2.150mM Nacl(0.87%Nacl,生理盐水)

3.0.1mg/mL考马斯亮兰G-250溶液 蛋白定量用。用50ml 95%乙醇溶解100mg考马斯亮兰G-250,再加入100ml 85%磷酸，加水至1000ml。用Whatman滤纸过滤后，置棕色瓶4度保存。蛋白定量比色皿可用95%乙醇脱色。

4.考马斯亮兰脱色液 含50%甲醇、10%冰醋酸、40%去离子水。

5. 0.25%考马斯亮兰R-250溶液 染色用。100ml脱色液中加入0.25g考马斯亮兰R-250。

6.10mg/mlBSA，称取100mg小牛血清白蛋白溶于10ml灭菌去离子水中。置-20度冰箱保存。

7.1mol/L Tris-Hcl缓冲液,PH6.8

8.1.5 mol/L Tris-Hcl缓冲液,PH8.8

9.10% AP：过硫酸铵(Ammonium Persulfate,AP),Amresco分装，为促凝剂,现配现用，准确称取AP 20mg于0.5ml离心管内(注：称量时可分装数管室温保存备用)临用前加去离子水200ul溶解。配制好的AP溶液4C可保存1周。

10.TEMED,Amresco分装，100ml包装，为促凝剂,准确吸取TEMED 10ul于0.2ml离心管内,可分装数管室温保存备用。

11.10% SDS  在90ml去离子水中溶解10g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加入去离子水定容至100ml，室温保存。

12.30% Acr  将29g丙烯酰胺和1gN,N’－亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器(0.45孔径)过滤除菌查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中4度保存。

13.6xLoading buffer：6倍sample buffer

300mM tris.Hcl pH=6.8  ， 12% SDS ，0.6% bromophenol blue (溴酚蓝)，60%Glycerol,甘油

Filted，分装在1ml tube, 每毫升加43ul B-ME（β－巯基乙醇，还原剂），-20度保存。

14.蛋白Marker：  选择最适分子量Marker(MBI公司蛋白Marker很好)

15.内参：可选择最适分子量内参做1:3000-5000稀释，如B-Actin(45KD，浆蛋白用)、GAPDH(36KD，浆蛋白用，上海康成生物经销)、B-Tubulin(核蛋白用)等。

16.1xTris-Glycine电泳缓冲液(PH8.3)

25mM tris,192mM Glycine, 0.1%(w/v)SDS,

500ml配方如下

Tris1.515g, glycine7.2g, SDS0.5g用去离子水加至500ml。加10M HCl约800ul，就可以调至pH8.3。

17.1xTransfer buffer(PH8.3)

25mM tris, 192mM Glycine, 20%Methanol（甲醇），ph为8.3

 500ml配方如下

Tris 1.515g,glycine7.2g,100ml Methanol（甲醇），用去离子水加至500ml。加10M HCl约550ul，就可以调至pH8.3。

18. TBST Washing buffer：

50mM tris, 150mM Nacl, 0.1% Tween-20

1L配方如下

Tris 6.06g,NaCl8.7g,1mlTween-20,加入去离子水至1L，同时精确调准pH值为7.6。加10M HCl约4200ul，就可以调至7.6。Tween-20要在用前现加，未加Tween-20的称为TBS缓冲液。

19.5%的脱脂奶粉封闭液  用TBST Washing buffer配制。

20.一抗：santa原装或北京中山分装,一般做1:200-300稀释。

21.HRP标记二抗：一般做1:3000-5000稀释。二抗选择原则如下：

  如一抗为鼠抗人IgG, 二抗选择羊抗(或兔抗)鼠HRP；

如一抗为羊抗人IgG, 二抗选择鼠抗(或兔抗)羊HRP；

如一抗为兔抗人IgG, 二抗选择羊抗(或鼠抗)兔HRP。

22.ECL化学发光显色剂，或DAB显色剂

三.总蛋白质提取

1．培养细胞

1.1贴壁细胞数目达到培养皿(或培养瓶)底面积80－90%，最好前一天换上新的培养液。

1.2将培养液吸净，用5ml左右4度PBS洗三次细胞平皿(洗净培养液中的胎牛血清等外源性蛋白)，将PBS吸净，加入triple-detergent lysis buffer，100mm培养皿加300ul。(蛋白质种类不同—浆蛋白、核蛋白、膜蛋白，细胞裂解液有所不同)如暂时不提取，可将培养皿-80度保存。

1.3轻轻的转动培养皿直到细胞被溶解下来，细胞刮轻轻刮下裂解物，并可见白色的核酸(DNA、RNA)沉淀，（约1分钟）将所有的液体包括沉淀，吸入1.5ml离心管，旋涡混匀器30秒，放在冰上10分钟使细胞充分裂解，然后，用4度离心机12000转10分钟。

1.4留10ul上清液做蛋白定量外，其余上清于另一1.5ml离心管(将蛋白样品5份+1份6×loading buffe，6×loading buffe加入前用80度左右的水预热一下，使其溶解充分。把样品在100度的沸水中煮5分钟使蛋白变性，离心管上标明蛋白含量，保存在-80度冰箱)

2.组织中蛋白提取

2.1特小的组织加300ulLysis buffer玻璃匀浆器中，冰浴中研磨数次，匀浆上清液吸入1.5ml离心管中，然后，用4度离心机12000转10分钟。吸取上清于另一1.5ml离心管，分装，保存在-80度冰箱。留10ul上清液做蛋白定量。

2.2取50－100mg组织放入玻璃匀浆器中，加3倍体积Lysis buffer，冰浴中研磨数次，匀浆上清液吸入1.5ml离心管中，然后，用4度离心机12000转10分钟。吸取上清于另一1.5ml离心管，分装，保存在-80度冰箱。留10ul上清液做蛋白定量。

四.蛋白质定量

1.应用标准的Bradford法定量。

2.待测样本各10ul＋90ul生理盐水；标准管中分别加入10mg/mlBSA 0ul、2.5ul、5.0ul、7.5ul、10ul, 每管加生理盐水至100ul(蛋白含量分别为0、25、50、75、100ug)，同时以100ul的生理盐水作空白对照。各管加入考马斯亮蓝染料溶液1900ul至总体积2ml，混匀，室温放置2分钟。比色检测作标准曲线，计算出各个样品的蛋白含量。

3.比色定量：通过OD值，来计算蛋白量。统计软件计算出结果；

五.样品准备

1.将已定量的蛋白样品5份+1份6×loading buffe，6×loading buffe加入前用80度左右的水预热一下，使其溶解充分。把样品在100度的沸水中煮5分钟， (水中煮沸5分钟，目的是让蛋白变性，由四级结构变成一级结构。注意事项：煮沸时，一定不要让离心管口弹开进入水，要随时观察。)

2.一般来讲蛋白上样量30ug；计算出每个样品30ug所用的体积，在样品管上标记体积数值，以后直接吸取就行了。

3.等体积上样：用事先准备好1×loading buffer，调成15ul相同体积。这样条带整齐。

六.蛋白电泳

1.分离胶制备

1.胶的选择：胶的浓度越大，所能分离蛋白的分子量越小。（阿恒觉得这里一般还是10%到15%的比较常用）

7.5% :45—200KD

10%: 31----200KD

12%: 21.5---200KD

15%6.5---200KD

2.10ml 10%分离胶制备

   去离子水                  3950ul

   30%Acr                    3350ul

   1.5MTris-Hcl,PH8.8        2500ul

   10%SDS                     100ul

   混匀;依次快速加入10%AP 100ul及TEMED 4ul,充分混匀但不要产生气泡。（这部很关键）

3.立即灌胶，不要产生气泡，如有气泡可用10ml注射器针头排除。在每侧胶板加胶至红色塑料板的下缘处即可（差不多4－5ml）

4.沿玻璃板壁缓慢加去离子水1cm高度，隔绝空气，分离胶室温凝固2小时以上。也可4度冰箱过夜。

2.5%积层胶制备

(配制积层胶前先倾斜玻璃板，使上面水层汇聚于一边，用10ml注射器吸取干净，静置10分钟左右，使水分蒸发干净)

2.1 4ml 5%积层胶制备

   去离子水                  2800ul

   30%Acr                     660ul

   1MTris-Hcl,PH6.8           500ul

   10%SDS                      40ul

混匀;依次快速加入10%AP 40ul及TEMED 4ul,充分混匀但不要产生气泡。立即灌胶，不要产生气泡，如有气泡可用10ml注射器针头排除。

2.2插上梳子，积层胶室温凝固30分钟以上。小心拨出梳子，若胶孔有歪斜，则用注射器加以修正，吸出气泡；（歪斜一般出现在基层胶凝固时间过短，或者配置比重过低，可用针头拨乱反正之，但是难度很高，容易挑破）

2.3去掉胶条，加入甘氨酸电泳缓冲液，内外持平；

2.4清洗胶孔：去除没有凝聚的Acr，并清除气泡。

3.点样：使用20ul的加样枪，采用“对侧加样法”加样。

4.电泳

电泳在4度冰箱中进行，积层胶90V，30分钟左右，待溴酚兰指示剂到达分离胶表面时改变电压120-130V，2小时左右――此方法可以保持胶内受热均匀，电流、电场均匀，条带齐规整）

5.剥离胶：在平皿中，用手术刀片小心剥离，切掉积层胶，取出分离胶，用于下一步试验。

七.转膜

1.准备一大的玻璃培养皿，

2.Tansfer buffer：配制500ml（一部分倒于玻璃皿中，以分离胶－制作夹心饼）；取胶－修剪胶：取胶时手应错开分离玻璃，使胶取出，去掉积层胶部分，修剪周边使其与预先制作好的硝酸膜大小一致，约长8cm、高5cm左右，NC膜用剪刀在一个角剪一个标记；制作夹心饼：黑负白正，从近负极面依次为“黑夹板＝海棉－滤纸（5层）－胶－膜－滤纸（5层）－海棉＝白夹板”形象“汉堡”或“夹心饼”；用玻璃棒赶尽气泡]（这步要一层层的赶气泡，气泡非常影响转膜结果）

3. Transfer time

4度6-12小时（4C转膜过夜，时间根据分子量的大小调整，大分子可以12小时，小的6小时左右）

4.将膜取下，用去离子水洗。

八.Western blot

blot之前可以用丽春红（ponceaus）染NC膜，以观察蛋白转膜情况（是否完全、条带是否齐）。然后用自来水或washing buffer洗掉丽春红后进行印迹。可以跑两块胶，一块blot，一块染色观察。（其实，恩，染过色的胶洗掉还是可以用的，吼吼！）

步骤：

1.裁膜：根据电泳后蛋白Marker的位置，裁剪所需目的蛋白、内参对应的膜。

2.封闭抗体：将膜放入自制blot袋；封闭液用5％的美国脱脂奶粉（用TBST wash buffer配制），blot with milk for 1h RT，也可4度过夜。（这个做袋袋，也是很有意思地 = = 哈哈！）

3.加一抗：blot in primary antibody for 1.5h RT（抗体用milk稀释）

4.洗膜：wash with TBST wash buffer 5times, each time 3mins

5.加二抗：blot in secondary antibody 1h RT （抗体用milk稀释）

6.洗膜：wash with TBST wash buffer 5times, each time 3mins

九ECL显色

1.加ECL试剂10ml于100mm玻璃培养皿中，再加30%双氧水6ul(带上手套，防止腐蚀皮肤)（万一腐蚀了，皮肤变成白色的，又疼又养，这是一个比偶倒霉的哥哥告诉偶的）,摇匀。

2.用滤纸吸干NC膜上水分，将膜放入ECL显色液中显色，肉眼看到条带后，就可以取出，显色强的约几秒钟，显色弱的时间长些，但是不可以超过3分钟。

十.放射自显影,冲洗胶片

1.放射自显影操作在暗室进行。红色灯光下可避免底片曝光。切忌底片湿水。

2.用滤纸吸干膜上ECL显色液,先将膜放入暗盒内，再放X胶片，根据目的条带ECL显色的强弱决定曝光时间。 （伸手不见5指的曝光，经常大眼瞪小眼的看条带）

3.目的条带ECL显色肉眼可以看到的话，说明比较强，曝光时间可以短些，“3分钟、5分钟各一张＋必不可以少的10分钟一张”；肉眼看不见，曝光时间可以长些，“不可以少的10分钟，15分钟、30分钟各一张”。

4.一般来说，曝光三张已足够用。（偶一口气爆上6张，左眼看3张，右眼看3张，嘿嘿~~）

5.放射科冲洗X胶片，读片。

6.X胶片扫描保存。

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