奔驰消防进口车价格:Rt －PCR实验操作步骤

RT-PCR实验操作步骤 （转）

默认分类 2007-12-25 17:51:05 阅读233 评论1   字号：大中小 订阅

一.所用试剂

 1.0.01MPBS缓冲液,PH7.4 ：高压灭菌，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。

 2.焦碳酸二乙酯(DEPC)：sigma公司，40C保存。

 3.0.1%DEPC处理的灭菌去离子水：100ml去离子水中加入0.1mlDEPC，剧烈振荡混匀，让DEPC充分进入溶液中，370C放置过夜，高压蒸汽灭菌30分钟除去DEPC。40C保存。

 4.单相细胞裂解试剂TRizoL：Invitrogen生命技术公司，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。

 5.氯仿：用新开封的，10ml分装，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。

 6.异丙醇：用新开封的，20ml分装，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。

 7.0.1%DEPC处理的75％乙醇：无水乙醇75ml加0.1%DEPC处理的灭菌去离子水至100ml，4C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。

 8.cDNA反转录试剂盒：MBI公司，－200C保存。

 9.2xPCR试剂：MBI公司，－200C保存。

 10.5xTBE RNA电泳缓冲液：因为Tris碱可与DEPC发生反应并使之失活，所以含Tris碱的电泳缓冲液可用DEPC处理的灭菌去离子水配制，0.22um滤器过滤除菌。室温保存，临用前用DEPC处理的灭菌去离子水10倍稀释。使用本室RNA专用电泳槽，每次需配制0.5x电泳缓冲液500ml。

 11.50xTAE DNA电泳缓冲液：室温保存，临用前用去离子水50倍稀释。使用本室DNA专用电泳槽，每次需配制1x电泳缓冲液1000ml。

 12.6x上样缓冲液：1.5mlDEPC处理的灭菌离心管中称取2.5mg溴酚蓝，加入0.3ml甘油，DEPC处理的灭菌去离子水定容至1ml，40C保存。

 13.1.5％琼脂糖：RNA电泳，1.5g琼脂糖加入0.5xTBE RNA电泳缓冲液中;DNA电泳, 1.5g琼脂糖加入1xTAE DNA电泳缓冲液中。微波炉煮沸熔化后，冷却至600C左右，每100ml胶加入溴化乙啶(EB,10mg/ml)5ul。

 14.溴化乙锭（10mg/ml）：在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。

 15.人淋巴细胞分离液：上海华精生化试剂厂。

二.总RNA提取

[注]1.本方法采用Chomczynski一步法，用单相细胞裂解试剂TRizoL破碎细胞和灭活细胞中内源性RNA酶同步进行，可同时分离RNA、DNA和蛋白质。TRizoL中含有酚、强变性剂硫氰酸狐和溶解剂等。本法所提取的RNA可用于RT-PCR、Northern印迹杂交等。

    2.最好单独存放用于RNA实验的试剂，以防止污染。

    3.耐高温的匀浆器、研钵及研棒用锡箔纸包好，2000C干烤5小时，灭活外源性RNA酶。

    4.离心管、枪头等塑料制品用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡12小时以上灭活外源性RNA酶。再用去离子水浸泡10分钟x3次，以去除DEPC，然后70-800C烤干，高压蒸汽灭菌30分钟除去残留的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。

    5.提取RNA所用的去离子水及配制试剂均要经含0.1%DEPC处理。   

    6.如果是从完整包装中新取出的塑料制品，一般无外源性RNA酶污染，可以直接使用。

    7.实验者的双手是外源性RNA酶的重要污染源，因此务必戴手套进行操作。

    8.DEPC为可疑致癌物，且有芳香性挥发气味，使用时应戴手套、口罩，并打开排气扇。

    9.RNA紫外分光光度计定量所用石英比色皿使用后，在1：1盐酸甲醇中浸泡30分钟以上，再用0.1%DEPC处理去离子水冲洗干净，凉干。

    10.用于RNA电泳的电泳槽用去污剂清洗干净，自来水冲洗数次，再用去离子水冲洗1次，无水乙醇擦洗，干燥。然后灌满3％的双氧水室温放置10分钟，最后用DEPC处理的去离子水冲洗3次。

    11.提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳后，28S rRNA和18S rRNA应当能清楚地在紫外分析仪下看到，也应当能看到一条由tRNA, 5.8S rRNA和5S rRNA组成的，较模糊迁移较快的带。如果RNA没有被降解，28S rRNA的亮度应当是18S rRNA亮度的两倍，且这两条带都没有弥散现象。加样孔附近有条带表明产物中混有DNA。

(一).培养细胞中RNA提取

 1.贴壁生长的细胞：倒出培养液，加5ml无菌冰冷的PBS缓冲液冲洗细胞2次。倒出PBS缓冲液(尽量空干)，加入1mlTRizoL,用力振荡培养瓶或培养皿(贴壁较牢固的细胞可用细胞刮刀刮取细胞)，使细胞完全脱落，用加样器吹打均匀，吸入1.5ml离心管中，漩涡混匀器振荡30秒，室温静置5分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。悬浮生长的细胞：细胞悬液倒入10-15ml离心管，2000转/分离心10分钟收集细胞，倒出培养液，加2ml无菌冰冷的PBS缓冲液，混匀使细胞沉淀重悬洗涤细胞2次。再2000转/分离心10分钟收集细胞，倒出PBS缓冲液(尽量空干)，加入1mlTRizoL,用加样器吹打均匀，吸入1.5ml离心管中，漩涡混匀器振荡30秒，室温静置5分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。

 2.加氯仿200ul,漩涡混匀器振荡30秒，冰盒上静置10分钟，

 3.高速冷冻离心机（温度设定40C）12000/分离心15分钟，使混合物分为两相(RNA留在水相，DNA和蛋白质被抽提进氯仿层)，吸取上层水相0.5ml移至一个新的1.5ml离心管中，加异丙醇0.5ml。充分混匀，冰盒上静置10分钟，使RNA充分沉淀。

 4.高速冷冻离心机（温度设定40C）12000/分离心15分钟,弃去上清液,加入冰冷75%乙醇1ml洗涤RNA沉淀,漩涡混匀器振荡30秒.

 5.高速冷冻离心机（温度设定40C）8000/分离心5分钟,弃去上清液,沉淀快速风干。但不要完全干燥这一点非常重要，否则RNA沉淀溶解度会大大降低。可通过在55－600C加热并用枪头反复吹打溶液增加RNA的溶解度。

 6.提取的RNA加适量DEPC处理去离子水溶解(组织及培养细胞所提RNA加水50－100ul外周血白细胞所提RNA加水10－15ul)。取5ul+1ul6x电泳上样缓冲液点样，电压120-130V电泳30分钟左右，如在紫外分析仪下可见5S、18S及28S三条带出现，说明已提出RNA。5S条带较模糊迁移较快。如果RNA没有被降解，28S rRNA的亮度应当是18S rRNA亮度的两倍，且这两条带都没有弥散现象。加样孔附近有条带表明产物中混有DNA。RNA纯度鉴定及定量可用紫外分光光度计，取2ul＋148ul去离子水测A260nm/280nm，比值应在1.8-2.0之间。RNA浓度(ug/ml)=A260x稀释倍数x40。对大多数细胞株来说，一个100ml培养瓶中培养细胞的RNA收率为100－200ug。

7.如暂时不做反转录，,立即放-800C冰箱冻存。

贴壁细胞总RNA提取操作流程
 I

细胞长满80%瓶底或皿底，换培养液，第二天提取RNA

 (倒掉培养液，5-10ml冰PBS洗涤细胞2次空干)

加1ml冰TRizoL,用力振荡培养瓶使细胞完全脱落，加样器吹打

(吸入1.5ml离心管，旋涡振荡10秒，室温静置5分钟)
 
加氯仿200ul,漩涡混匀器振荡10秒，冰盒上静置10分钟
 
(40C,8000rpm,5分钟，)

吸取上层水相0.5-0.7ml移至另一1.5ml离心管中，加异丙醇0.5-0.7ml
 
(充分混匀，冰盒上静置10分钟，40C,12000rpm,15分)

弃上清,加75%冰乙醇1ml, 颠倒混匀数次

(40C,12000rpm,15分)

弃上清,沉淀快速风干。但不要完全干燥, 加DEPC处理去离子水50-100ul

 取5ul作RNA电泳，5ul作RNA定量，余-800C冰箱保存

(二).组织中RNA提取

 1.组织收集：新鲜组织立即放入液氮中30分钟以上后，可在-800C冰箱保存，数月内不会影响RNA的产量及质量。

 2.取组织50-100mg放入1ml玻璃匀浆器中，加入1mlTRizoL,在冰浴中研磨，悬液转入1.5ml离心管中，室温静置5分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。高速冷冻离心机（温度设定40C）12000/分离心5分钟，上清液倒入另一1.5ml离心管中。

 3.以下步骤同培养中细胞RNA提取法(2-7)。

 (三)外周血白细胞RNA提取

 1.抽取静脉血5ml,注入0.5ml 3.8％枸橼酸钠（血液：抗凝剂＝10：1）的抗凝管中，加盖颠倒混匀2-3次。

 2.将上述抗凝血倒入15ml离心管中，加5mlPH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）等量稀释。

 3吸取5ml淋巴细胞分离液（上海华精生物技术公司生产）加入另一15ml离心管中。

 4.将稀释后的抗凝血10ml沿管壁缓慢加到淋巴细胞分离液上，水平离心机2000转/分离心20分钟。

 5.吸取中间白细胞层至另一15ml离心管中，加入5mlPH7.4PBS缓冲液混匀（洗涤白细胞），4000转/分离心5分钟。弃去上清液，所得白色沉淀即为单个核细胞，如暂时不提取RNA,立即-800C冰箱冻存。

 6.加入TRizoL(Invitrogen生命技术公司生产)1ml,用加样器吹打均匀，吸入1.5ml离心管中，漩涡混匀器振荡30秒，室温静置5分钟，使核蛋白完全从核酸上解离。

7.以下步骤同培养中细胞RNA提取法(2-7)。

三.反转录

参见不同厂家试剂盒说明书，以本室使用的Fermentas MBI公司(#K1621)cDNA反转录两步法试剂盒为例。一步法是将反转录及PCR反应的所有试剂加在一个反应体系(EP管)，缺点是试剂用量大，反应条件不好掌握；两步法是先反转录，然后进行PCR反应。

反转录反应

（1）在超净台中，取DEPC处理的200μlPCR管置冰上，依次加入

       总RNA                        1μg(2ul)

       随即引物(0.5μg/μl)         1μl

       无RNA酶水                   9ul至总体积12μl

       混匀，用微量离心机离心3000转/分30秒。

（2）置PCR仪上70℃5分钟变性，取出置冰上冷却。

（3）PCR管置冰上，依次加入

       5×RT Buffer                       4μl

       RNase inhibitor(20U/μl)           1μl

       10mM dNTP Mix                     2μl

       混匀，用微量离心机离心3000转/分30秒。

（4）置PCR仪上25℃5分钟。取出置冰上冷却。

（5）加入M-MuLV逆转录酶（200U/μl）1μl至终体积20μl。

（6）置PCR仪上按以下条件进行

       25℃                               10分钟

       42℃                               60分钟

       70℃                               10分钟

    立即冰上冷却，产物cDNA即用于PCR或置-20℃冰箱保存。

四.PCR反应

（1）取200μIPCR管依次加入

       2×PCR Master Mix                    12.5μl

       cDNA                                2.0μl

       上游引物                            1μl

       下游引物                            1μl

       灭菌去离子水                        8.5ul至25μl

用微量离心机离心3000转/分30秒混匀。

（2）按以下条件进行PCR反应：

        94℃        5分钟             预变性

        94℃        30秒              变性

        55-60℃     45秒              退火

        72℃        45秒              延伸，共30-35个循环

72℃        7分钟             最终延伸。

五.实验对照

1.阳性对照：采用已知高表达细胞的总RNA进行逆转录和PCR扩增。

2.阴性对照：用灭菌去离子水代替总RNA的反应体系进行逆转录和PCR扩增。

3.内参照：以引物进行PCR反应的同时，以β-actin引物(或者GAPDH引物)进行PCR反应。

六.琼脂糖凝胶电泳

   取内参照扩增产物及PCR产物15ul+3ul 6x上样缓冲液，同时用相应的5-8ul DNA Marker,2%琼脂糖凝胶电泳，电压110-120V，30-45分钟。

七.紫外分析仪观察、数码照相

于紫外透视仪下观察有无特异性扩增带，并照相记录。

β-actin扩增产物大小540bp，340 bp。

   GAPDH扩增产物大小142bp。

1、载玻片的处理：

抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：

1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。

1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。

1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。

2、常用酶消化：

2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。

2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。

2.3 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。?皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10

3、抗原热修复：

可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 ?枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。

3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。

3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。

3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。

4、免疫组化染色步骤：

（以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）

石蜡切片脱蜡至水。

3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。

5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜(两次温箱1小时，效果都很差。这次用4度过夜看看)。

PBS冲洗，5分钟×3次。

滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

PBS冲洗，5分钟×3次。

滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

PBS冲洗，5分钟×3次。

显色剂显色（DAB或AEC）。

自来水充分冲洗，复染，封片。

冰冻切片免疫组化染色步骤

m，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。?冰冻切片4~8

下接免疫组化染色操作步骤。

一.所需仪器设备

1.电泳仪

2.垂直电泳槽

3.转移电泳槽:湿转或半干转电泳槽

4.硝酸纤维素膜(NC膜)

5.暗盒

6.5x7cm X胶片

[注：电泳槽、玻璃板、梳子及胶条的清洗：自来水冲洗数次――去离子水冲洗数次2次――37C烤干备用。]

二.所用试剂

[注：配制及稀释试剂均用去离子水，实验器皿自来水清洗完毕再用去离子水冲洗]

1.Lysis buffer：RIPA 三去污剂裂解缓冲液

 50mM Tris.Hcl                                  3.03g

  150mM NaCl  生理盐水                           4.35g

  0.02%NaN3（防腐剂，可以不加）                  0.1g

  0.1%SDS  强阴离子去污剂                        0.5g

  1% NP-40 去污剂                                5ml

  0.5% Sodium deoxycholate 去氧胆酸钠  去污剂    2.5g

配制500ml,10M盐酸调PH8.0, 4度保存。

使用前按1：50加入100mM PMSF(苯甲基磺酰氟，平时放-20度)和protease inhibitor(先溶在2ML水中，分装在小管中，保存在-20度)，配好后马上使用。也可分装成(RIPA300ul+6ul100mM PMSF+6ulprotease inhibitor)(培养细胞及微小组织蛋白提取)若干管，-20度保存；分装成(RIPA1000ul+20ul100mM PMSF+20ulprotease inhibitor)(较大组织蛋白提取)若干管，-20度保存。

[注：也可使用单去污剂裂解缓冲液，将1% NP-40换为1%Triton X-100。去掉0.1%SDS及0.5% Sodium deoxycholate 去氧胆酸钠]

PMSF储存液 100mM(17.4mg/ml)，溶于异丙醇。有效浓度100ug/ml。

2.150mM Nacl(0.87%Nacl,生理盐水)

3.0.1mg/mL考马斯亮兰G-250溶液 蛋白定量用。用50ml 95%乙醇溶解100mg考马斯亮兰G-250,再加入100ml 85%磷酸，加水至1000ml。用Whatman滤纸过滤后，置棕色瓶4度保存。蛋白定量比色皿可用95%乙醇脱色。

4.考马斯亮兰脱色液 含50%甲醇、10%冰醋酸、40%去离子水。

5. 0.25%考马斯亮兰R-250溶液 染色用。100ml脱色液中加入0.25g考马斯亮兰R-250。

6.10mg/mlBSA，称取100mg小牛血清白蛋白溶于10ml灭菌去离子水中。置-20度冰箱保存。

7.1mol/L Tris-Hcl缓冲液,PH6.8

8.1.5 mol/L Tris-Hcl缓冲液,PH8.8

9.10% AP：过硫酸铵(Ammonium Persulfate,AP),Amresco分装，为促凝剂,现配现用，准确称取AP 20mg于0.5ml离心管内(注：称量时可分装数管室温保存备用)临用前加去离子水200ul溶解。配制好的AP溶液4C可保存1周。

10.TEMED,Amresco分装，100ml包装，为促凝剂,准确吸取TEMED 10ul于0.2ml离心管内,可分装数管室温保存备用。

11.10% SDS  在90ml去离子水中溶解10g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加入去离子水定容至100ml，室温保存。

12.30% Acr  将29g丙烯酰胺和1gN,N’－亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器(0.45孔径)过滤除菌查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中4度保存。

13.6xLoading buffer：6倍sample buffer

300mM tris.Hcl pH=6.8  ， 12% SDS ，0.6% bromophenol blue (溴酚蓝)，60%Glycerol,甘油

Filted，分装在1ml tube, 每毫升加43ul B-ME（β－巯基乙醇，还原剂），-20度保存。

14.蛋白Marker：  选择最适分子量Marker(MBI公司蛋白Marker很好)

15.内参：可选择最适分子量内参做1:3000-5000稀释，如B-Actin(45KD，浆蛋白用)、GAPDH(36KD，浆蛋白用，上海康成生物经销)、B-Tubulin(核蛋白用)等。

16.1xTris-Glycine电泳缓冲液(PH8.3)

25mM tris,192mM Glycine, 0.1%(w/v)SDS,

500ml配方如下

Tris1.515g, glycine7.2g, SDS0.5g用去离子水加至500ml。加10M HCl约800ul，就可以调至pH8.3。

17.1xTransfer buffer(PH8.3)

25mM tris, 192mM Glycine, 20%Methanol（甲醇），ph为8.3

 500ml配方如下

Tris 1.515g,glycine7.2g,100ml Methanol（甲醇），用去离子水加至500ml。加10M HCl约550ul，就可以调至pH8.3。

18. TBST Washing buffer：

50mM tris, 150mM Nacl, 0.1% Tween-20

1L配方如下

Tris 6.06g,NaCl8.7g,1mlTween-20,加入去离子水至1L，同时精确调准pH值为7.6。加10M HCl约4200ul，就可以调至7.6。Tween-20要在用前现加，未加Tween-20的称为TBS缓冲液。

19.5%的脱脂奶粉封闭液  用TBST Washing buffer配制。

20.一抗：santa原装或北京中山分装,一般做1:200-300稀释。

21.HRP标记二抗：一般做1:3000-5000稀释。二抗选择原则如下：

  如一抗为鼠抗人IgG, 二抗选择羊抗(或兔抗)鼠HRP；

如一抗为羊抗人IgG, 二抗选择鼠抗(或兔抗)羊HRP；

如一抗为兔抗人IgG, 二抗选择羊抗(或鼠抗)兔HRP。

22.ECL化学发光显色剂，或DAB显色剂

三.总蛋白质提取

1．培养细胞

1.1贴壁细胞数目达到培养皿(或培养瓶)底面积80－90%，最好前一天换上新的培养液。

1.2将培养液吸净，用5ml左右4度PBS洗三次细胞平皿(洗净培养液中的胎牛血清等外源性蛋白)，将PBS吸净，加入triple-detergent lysis buffer，100mm培养皿加300ul。(蛋白质种类不同—浆蛋白、核蛋白、膜蛋白，细胞裂解液有所不同)如暂时不提取，可将培养皿-80度保存。

1.3轻轻的转动培养皿直到细胞被溶解下来，细胞刮轻轻刮下裂解物，并可见白色的核酸(DNA、RNA)沉淀，（约1分钟）将所有的液体包括沉淀，吸入1.5ml离心管，旋涡混匀器30秒，放在冰上10分钟使细胞充分裂解，然后，用4度离心机12000转10分钟。

1.4留10ul上清液做蛋白定量外，其余上清于另一1.5ml离心管(将蛋白样品5份+1份6×loading buffe，6×loading buffe加入前用80度左右的水预热一下，使其溶解充分。把样品在100度的沸水中煮5分钟使蛋白变性，离心管上标明蛋白含量，保存在-80度冰箱)

2.组织中蛋白提取

2.1特小的组织加300ulLysis buffer玻璃匀浆器中，冰浴中研磨数次，匀浆上清液吸入1.5ml离心管中，然后，用4度离心机12000转10分钟。吸取上清于另一1.5ml离心管，分装，保存在-80度冰箱。留10ul上清液做蛋白定量。

2.2取50－100mg组织放入玻璃匀浆器中，加3倍体积Lysis buffer，冰浴中研磨数次，匀浆上清液吸入1.5ml离心管中，然后，用4度离心机12000转10分钟。吸取上清于另一1.5ml离心管，分装，保存在-80度冰箱。留10ul上清液做蛋白定量。

四.蛋白质定量

1.应用标准的Bradford法定量。

2.待测样本各10ul＋90ul生理盐水；标准管中分别加入10mg/mlBSA 0ul、2.5ul、5.0ul、7.5ul、10ul, 每管加生理盐水至100ul(蛋白含量分别为0、25、50、75、100ug)，同时以100ul的生理盐水作空白对照。各管加入考马斯亮蓝染料溶液1900ul至总体积2ml，混匀，室温放置2分钟。比色检测作标准曲线，计算出各个样品的蛋白含量。

3.比色定量：通过OD值，来计算蛋白量。统计软件计算出结果；

五.样品准备

1.将已定量的蛋白样品5份+1份6×loading buffe，6×loading buffe加入前用80度左右的水预热一下，使其溶解充分。把样品在100度的沸水中煮5分钟， (水中煮沸5分钟，目的是让蛋白变性，由四级结构变成一级结构。注意事项：煮沸时，一定不要让离心管口弹开进入水，要随时观察。)

2.一般来讲蛋白上样量30ug；计算出每个样品30ug所用的体积，在样品管上标记体积数值，以后直接吸取就行了。

3.等体积上样：用事先准备好1×loading buffer，调成15ul相同体积。这样条带整齐。

六.蛋白电泳

1.分离胶制备

1.胶的选择：胶的浓度越大，所能分离蛋白的分子量越小。（阿恒觉得这里一般还是10%到15%的比较常用）

7.5% :45—200KD

10%: 31----200KD

12%: 21.5---200KD

15%6.5---200KD

2.10ml 10%分离胶制备

   去离子水                  3950ul

   30%Acr                    3350ul

   1.5MTris-Hcl,PH8.8        2500ul

   10%SDS                     100ul

   混匀;依次快速加入10%AP 100ul及TEMED 4ul,充分混匀但不要产生气泡。（这部很关键）

3.立即灌胶，不要产生气泡，如有气泡可用10ml注射器针头排除。在每侧胶板加胶至红色塑料板的下缘处即可（差不多4－5ml）

4.沿玻璃板壁缓慢加去离子水1cm高度，隔绝空气，分离胶室温凝固2小时以上。也可4度冰箱过夜。

2.5%积层胶制备

(配制积层胶前先倾斜玻璃板，使上面水层汇聚于一边，用10ml注射器吸取干净，静置10分钟左右，使水分蒸发干净)

2.1 4ml 5%积层胶制备

   去离子水                  2800ul

   30%Acr                     660ul

   1MTris-Hcl,PH6.8           500ul

   10%SDS                      40ul

混匀;依次快速加入10%AP 40ul及TEMED 4ul,充分混匀但不要产生气泡。立即灌胶，不要产生气泡，如有气泡可用10ml注射器针头排除。

2.2插上梳子，积层胶室温凝固30分钟以上。小心拨出梳子，若胶孔有歪斜，则用注射器加以修正，吸出气泡；（歪斜一般出现在基层胶凝固时间过短，或者配置比重过低，可用针头拨乱反正之，但是难度很高，容易挑破）

2.3去掉胶条，加入甘氨酸电泳缓冲液，内外持平；

2.4清洗胶孔：去除没有凝聚的Acr，并清除气泡。

3.点样：使用20ul的加样枪，采用“对侧加样法”加样。

4.电泳

电泳在4度冰箱中进行，积层胶90V，30分钟左右，待溴酚兰指示剂到达分离胶表面时改变电压120-130V，2小时左右――此方法可以保持胶内受热均匀，电流、电场均匀，条带齐规整）

5.剥离胶：在平皿中，用手术刀片小心剥离，切掉积层胶，取出分离胶，用于下一步试验。

七.转膜

1.准备一大的玻璃培养皿，

2.Tansfer buffer：配制500ml（一部分倒于玻璃皿中，以分离胶－制作夹心饼）；取胶－修剪胶：取胶时手应错开分离玻璃，使胶取出，去掉积层胶部分，修剪周边使其与预先制作好的硝酸膜大小一致，约长8cm、高5cm左右，NC膜用剪刀在一个角剪一个标记；制作夹心饼：黑负白正，从近负极面依次为“黑夹板＝海棉－滤纸（5层）－胶－膜－滤纸（5层）－海棉＝白夹板”形象“汉堡”或“夹心饼”；用玻璃棒赶尽气泡]（这步要一层层的赶气泡，气泡非常影响转膜结果）

3. Transfer time

4度6-12小时（4C转膜过夜，时间根据分子量的大小调整，大分子可以12小时，小的6小时左右）

4.将膜取下，用去离子水洗。

八.Western blot

blot之前可以用丽春红（ponceaus）染NC膜，以观察蛋白转膜情况（是否完全、条带是否齐）。然后用自来水或washing buffer洗掉丽春红后进行印迹。可以跑两块胶，一块blot，一块染色观察。（其实，恩，染过色的胶洗掉还是可以用的，吼吼！）

步骤：

1.裁膜：根据电泳后蛋白Marker的位置，裁剪所需目的蛋白、内参对应的膜。

2.封闭抗体：将膜放入自制blot袋；封闭液用5％的美国脱脂奶粉（用TBST wash buffer配制），blot with milk for 1h RT，也可4度过夜。（这个做袋袋，也是很有意思地 = = 哈哈！）

3.加一抗：blot in primary antibody for 1.5h RT（抗体用milk稀释）

4.洗膜：wash with TBST wash buffer 5times, each time 3mins

5.加二抗：blot in secondary antibody 1h RT （抗体用milk稀释）

6.洗膜：wash with TBST wash buffer 5times, each time 3mins

九ECL显色

1.加ECL试剂10ml于100mm玻璃培养皿中，再加30%双氧水6ul(带上手套，防止腐蚀皮肤)（万一腐蚀了，皮肤变成白色的，又疼又养，这是一个比偶倒霉的哥哥告诉偶的）,摇匀。

2.用滤纸吸干NC膜上水分，将膜放入ECL显色液中显色，肉眼看到条带后，就可以取出，显色强的约几秒钟，显色弱的时间长些，但是不可以超过3分钟。

十.放射自显影,冲洗胶片

1.放射自显影操作在暗室进行。红色灯光下可避免底片曝光。切忌底片湿水。

2.用滤纸吸干膜上ECL显色液,先将膜放入暗盒内，再放X胶片，根据目的条带ECL显色的强弱决定曝光时间。 （伸手不见5指的曝光，经常大眼瞪小眼的看条带）

3.目的条带ECL显色肉眼可以看到的话，说明比较强，曝光时间可以短些，“3分钟、5分钟各一张＋必不可以少的10分钟一张”；肉眼看不见，曝光时间可以长些，“不可以少的10分钟，15分钟、30分钟各一张”。

4.一般来说，曝光三张已足够用。（偶一口气爆上6张，左眼看3张，右眼看3张，嘿嘿~~）

5.放射科冲洗X胶片，读片。

6.X胶片扫描保存。

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